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外泌體的這些哪些事?

發(fā)布時間: 2023-09-14  點擊次數(shù): 589次

 

常用外泌體研究樣本來源有哪些?

Chris Gardiner2016發(fā)表的調(diào)查報告有報道細胞培養(yǎng)上清液是經(jīng)常使用來提取外泌體的樣本來源,除了細胞上清,其他最常見的體液是血漿(47%)、血清(22%)、尿液(14%)、腦脊液(8%)和乳汁(5%)

如何鑒定提取出來的外泌體?

以目前外泌體的分離手段很難獲得十分純凈而且單一的外泌體樣品,也沒有任何一個單一實驗可以確定外泌體的存在。根據(jù)國際細胞外囊泡協(xié)會發(fā)表的指導(dǎo)手冊《MISEV 2018》,外泌體特征鑒定通過NTA測粒徑分布、TEM電鏡分析形態(tài)、WB檢測標(biāo)志蛋白三項來驗證。NTA分析樣品中外泌體的粒徑分布和顆粒濃度,TEM電子顯微鏡來觀察樣品中外泌體的形態(tài)特征,WB檢測外泌體標(biāo)志蛋白。

外泌體如何保存?
不同時間、溫度的保存對不同的外泌體樣本影響不一;如果研究方向為外泌體形態(tài)特征、蛋白或其他功能性分析,在分離后新鮮使用為最佳。目前主流的建議是提取出外泌體后最好是新鮮使用,或低溫短期保存。短時間幾天內(nèi)可以放4°C,長時間儲存置于-80°C保存。
NTA檢測可以進行外泌體定量嗎?

NTA是物理方法,基于顆粒的布朗運動,因為不管是脂質(zhì)體、蛋白,甚至是PBS中的顆粒(部分實驗室自行配置的PBS中發(fā)現(xiàn)大量顆粒,推薦在外泌體研究中,用VC品牌的PBSP/N:C3580-0500),避免干擾),都會被軟件讀取,并不能分辨是否為外泌體。但NTA提供的粒徑分布可供判斷所提取的內(nèi)含物是否在外泌體的粒徑范圍內(nèi);另外,在做外泌體分泌的對比實驗中,NTA提供的濃度值也可以作為重要的參考數(shù)據(jù)。

外泌體NTA檢測需要多少量?

Zetaview儀器的最佳檢測區(qū)間是10^7 particles/ml,且有濃度檢測下限,為10^5 particles/ml,一般進樣量不少于2 ml;無法準(zhǔn)確建議送樣量,檢測需要量與樣本本身濃度有關(guān),樣本濃,則用量小,反之則多,根據(jù)檢測經(jīng)驗,樣本取用量一般在2 µl-100 µl不等,取用量大于50 µl時大多由于樣本分泌量過低、提取失敗或者對樣本有過多稀釋。

一般建議:送樣量不低于30 µl。

WB檢測哪個蛋白指標(biāo)?

外泌體相關(guān)文獻統(tǒng)計,排在前4位的檢測指標(biāo)為CD63、TSG101、CD9、CD81;接著檢測較多的4個指標(biāo)為Alix、HSP70、flotillinSyntenin等。然《MISEV 2018》并未提出可以特異性地表征外泌體的分子標(biāo)記。僅列出了必須在所有外囊泡制劑中分析的三類標(biāo)記物,以證明外囊泡(類別12)并評估其從常見污染物中的純度(類別3)。
注:
類別1:跨膜或GPI錨定蛋白,質(zhì)膜和/或胞內(nèi)體上任何類型外囊泡的標(biāo)志,如CD63、CD81、CD82CD9等;
類別2:細胞溶質(zhì)蛋白(cytosolic proteins ,真核細胞和革蘭氏陽性細菌)或周質(zhì)蛋白(periplasmicproteins,革蘭氏陰性細菌),分析確定脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu),如TSG101、HSP70ALIX等;

類別3:非外囊泡結(jié)構(gòu)的主要成分,通常與外囊泡共同分離。主要用來評估外囊泡制劑的純度,如血清、血漿中的脂蛋白。

即《MISEV 2018》要求外泌體標(biāo)志物鑒定,至少2個陽性指標(biāo):CD9、CD63、CD81 三選一以及TSG101HSP70、ALIX三選一,另外純度鑒定再加陰性對照。

WB檢測用什么內(nèi)參基因?

目前大部分文獻中沒有檢測內(nèi)參基因,個別文章中使用了Actin、GAPDHTubulin作為內(nèi)參進行檢測,從文獻調(diào)研結(jié)果來看,外泌體中的Actin、GAPDHTubulin的表達豐度相對于正常細胞樣品中的較低,Western blot檢測時可能會檢測不到任何條帶或者條帶微弱。因此,更多的是用等蛋白定量校準(zhǔn)樣品間的差異。

WB檢測需不需要裂解?

裂解和不裂解都可以,建議裂解,裂解后蛋白濃度會更高

外泌體電鏡是不是一定要有膜結(jié)構(gòu)?

負(fù)染電鏡結(jié)果中外泌體的形態(tài)是那種明顯的茶托樣,邊緣有一圈略微更明亮的亮圈。如果結(jié)構(gòu)是沒有膜結(jié)構(gòu)的圓球形,很可能是脂蛋白顆?;蛘弑F的蛋白質(zhì)。

外泌體研究中細胞培養(yǎng)用無血清還是血清培養(yǎng)?

外泌體研究中,如果仍然使用胎牛血清培養(yǎng)細胞、通過收集上清液來提取外泌體,胎牛血清中大量的牛源外泌體將對實驗分析造成極大的干擾。建議使用去外泌體血清培養(yǎng)細胞。

 

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